DAPI
DAPI ó (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) es un marcador fluorescente que se une fuertemente a regiones enriquecidas en adenina y timina en secuencias de ADN. Es utilizado ampliamente en la microscopía de fluorescencia. DAPI no puede pasar a través de la membrana celular, debido a eso, se utiliza para teñir células muertas.
DAPI fue sintetizado por primera vez en 1971 en el laboratorio de Otto Dann como parte de la búsqueda de fármacos con el fin buscar un tratamiento para la tripanosomiasis. A pesar de que no tuvo éxito como un medicamento, una investigación más extensa indicó que esta molécula se une fuertemente al ADN confiriéndole mayor fluorescencia. Esto encaminó su uso a la identificación de ADN mitocondrial por ultracentrifugación en 1975, este fue el primer uso registrado de DAPI como un marcador fluorescente de ADN. LA intensidad de fluorescencia debida a la unión de DAPI con las moléculas de ADN condujo a la rápida adopción de DAPI como marcador fluorescente de ADN usado en la microscopía de fluorescencia. Su uso para la detección de ADN en plantas, bacterias y metazoos y partículas virales se demostró en la década de 1970, y la tinción cuantitativa de ADN dentro de las células, se demostró en 1977. El uso de DAPI como un marcador de ADN para la citometría de flujo también se demostró alrededor de este tiempo.
Cuando DAPI se une a ADN bicatenario su máximo de absorción es a una longitud de onda de 358 nm (ultravioleta) y de su máximo de emisión es a 461 nm (azul). Por lo tanto en la microscopía de fluorescencia DAPI es excitado con luz ultravioleta para después ser detectado a través de un filtro azul / cian. DAPI también puede unirse a RNA, Sin embargo, aunque su pico de emisión es bastante amplio no es tan fluorescente. Su emisión se desplaza a alrededor de 500 nm cuando se une a ARN.
La emisión de luz azul de DAPI resulta conveniente para microscopistas que deseen utilizar múltiples marcadores fluorescentes en una sola muestra (citometría de flujo). Existe un cierto solapamiento entre la fluorescencia producida por DAPI y las moléculas de verde - fluorescentes como la fluoresceína y la proteína verde fluorescente (GFP), pero el efecto producido es mínimo. El uso de empalme espectral debido a este efecto puede ser evidente cuando se realiza un análisis de imagen extremadamente preciso. Otro uso para la microscopia de fluorescencia para DAPI es su popular uso el marcaje de cultivos celulares con la finalidad de detectar el ADN contaminado con micoplasma o virus. Las partículas de micoplasmas o virus marcados por DAPI en el medio de cultivo son más fáciles de detectar.
Perfil de Fluorescencia de excitación y emisión de DAPI unido a ADN bicatenario.
Este marcador fluorescente de ADN, recientemente ha sido modelado con eficacia utilizando la Teoría del funcional de la densidad tiempo-dependiente, junto con el modelo del continuo polarizable (IEF-PCM). Este modelo de la mecánica cuántica ha racionalizado el comportamiento de la absorción y la fluorescencia dada por la unión al surco menor y la intercalación en el sitio de la cadena ADN dirigido, en los términos de flexibilidad estructural reducida y polarización.
DAPI se puede utilizar para el marcaje de celular vivas, aunque la concentración de DAPI necesaria para la tinción de células vivas es generalmente muy alta y rara vez se utiliza. Se etiqueta como no tóxico en su Ficha de datos de seguridad y aunque no se muestra tener mutagenicidad en E. coli, se etiqueta como un mutágeno conocido en la información proporcionada por el fabricante. Como se trata de un compuesto de unión a ADN es muy probable que tenga algunas propiedades mutagénicas de bajo nivel y se debe tener cuidado en su manipulación y eliminación.
DAPI es un marcador nuclear que presenta mayor fotoestabilidad a diferencia de Hoechst_(colorante). DAPI se asocia con el surco menor del ADN de doble cadena, con preferencia por los grupos de adenina-timina. Las células deben ser permeabilizadas y / o fijadas para que DAPI pueda entrar en la célula y de unirse al ADN. La fluorescencia aumenta aproximadamente 20 veces cuando DAPI se une al ADN de doble cadena. El protocolo para el uso de DAPI como marcador de ADN en cultivo celular se describe a continuación:
Las células que han sido inmunomarcadas pueden ser teñidas con DAPI comenzando en el paso 7.
protocolo.
Las manchas de Hoechst son similares a DAPI en que también son manchas de ADN azul-fluorescentes compatibles con aplicaciones en vivo y células fijas, también visibles utilizando los mismos ajustes del filtro del equipo para DAPI.