PCR en tiempo real
La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q-PCR) o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, al igual que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable. A dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. en un termociclador provisto de sensores de fluorescencia, tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada. Dicha medición se realiza tras cada ciclo de amplificación, y es por esto que se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). En muchos casos, el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es ADN desde el principio, sino que puede ser ADN complementario (ADNc), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción de ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o RT-Q-PCR. Debe evitarse la confusión con la técnica denominada «PCR tras transcripción inversa» (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR), en la cual existe un paso de retrotranscripción de ARN a ADN pero que no necesariamente cuantifica el producto a tiempo real.
La PCR cuantitativa junto a los chip de ADN son modernas metodologías para el estudio de la expresión génica, aunque otros métodos tradicionales como el Northern blot, si bien no con tanta precisión, también permiten su abordaje. La variabilidad que se introduce en la cuantificación y que conlleva a errores en la estimación deriva de la integridad del ADN, la eficiencia enzimática y otros muchos factores, por lo que se han desarrollado numerosos sistemas de estandarización. Los hay para cuantificar de forma absoluta la expresión génica, pero, de forma más común, se orientan a la cuantificación relativa del gen de estudio respecto de otro, denominado «normalizador», que se selecciona por su expresión casi constante. Estos genes suelen denominarse, en inglés, house-keeping genes, ya que suelen estar involucrados en funciones básicas en la supervivencia celular, lo cual suele implicar una expresión constitutiva. De este modo, efectuando en cada experimento la medición de los genes de interés y dividiéndolos por la expresión del gen normalizador seleccionado es posible comparar los primeros aún sin conocer en términos absolutos su nivel de expresión. Los genes normalizadores más empleados son aquellos que codifican las siguientes proteínas: tubulina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, albúmina, ciclofilina, ARN ribosomales, etc.
La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rápidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y las enzimáticas de la ADN polimerasa.
El proceso de PCR, por lo general, consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten 25-40 veces, llamados ciclos, cada uno con un mínimo de tres etapas: la primero, en torno a los 95 °C, permite la separación de los ácidos nucleicos de doble cadena; la segunda, a una temperatura en torno a los 50-60 °C, permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde; la tercera, a 68-72 °C, facilita la polimerización por parte de la ADN polimerasa. Dado el pequeño tamaño de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el último paso, pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalización. Además, algunos termocicladores añaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura, por ejemplo 80 °C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dímeros de cebadores cuando se emplea un colorante inespecífico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros, tales como la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y desoxirribonucleótidos (dNTPs) en la reacción o la temperatura de unión de los cebadores.
Podemos clasificar las técnicas de PCR cuantitativa según el empleo de fluorocromos no específicos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.
La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de unión inespecífica a la doble hebra de ADN (generalmente SYBR Green) identificar fragmentos amplificados de ADN concretos a partir de la temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature), específica para el fragmento amplificado que se está buscando, y cuyos resultados se obtienen a partir de la observación de la curva de disociación de las muestras de ADN analizadas.
Ello permite, a diferencia de PCR convencional, prescindir del posterior empleo de técnicas de electroforesis para la visualización de los resultados de todas las muestras. Porque, pese a que la PCR cuantitativa es una técnica cinética, suele ser evaluada a punto final. Así, esta técnica lleva a la obtención de resultados más rápidos o con menor gasto de reactivos empleados en las técnicas de electroforesis. No obstante, según el criterio del investigador, posteriormente puede ser necesario correr en geles las muestras cuyo resultados previos en el PCR en tiempo real se pueden considerar dudosos o para ratificar resultados en muestras positivas.
La cuantificación puede realizarse en términos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la señal de amplificación obtenida con el contenido en ADN empleando una curva de calibrado; para este enfoque es vital que la PCR de la muestra y de los elementos de la recta de calibrado posean una misma eficiencia de amplificación. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresión de ARN mensajero (ARNm) interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por retrotranscripción del ARNm); esta cuantificación relativa es más fácil de realizar, puesto que no requiere curva de calibrado, y se sustenta en la comparación entre el nivel de expresión del gen a estudiar versus un gen control (también llamado de referencia, interno o normalizador o, en inglés, housekeeping gene).
Por tanto, en la cuantificación relativa es irrelevante en qué unidades se expresa la cuantificación, y sus resultados son comparables entre múltiples experimentos de RT-Q-PCR. De hecho, el propósito de emplear uno o más genes de normalización es corregir la variación no específica, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN empleado, que pueden afectar a las eficiencias de la retrotranscripción y PCR. No obstante, el aspecto crucial es que la estabilidad del gen de referencia sea una realidad.
La selección de los genes internos se ha realizado clásicamente en Biología Molecular analizando la estabilidad de la expresión en estudios cualitativos o de baja sensibilidad, como el examen visual de geles de ARN, densitometría de Northern blots o PCR semicuantitativa (PCR mimic). En plena era de la genómica, es posible realizar una aproximación a gran escala empleando los chips de ADN para muchos organismos. No obstante, se ha descrito que la mayoría de los genes empleados como normalizadores en la cuantificación de la expresión de ARN mensajero varían según las condiciones experimentales. Por ello, es preciso realizar un estudio metodológico previo a fin de seleccionar, con ayuda de herramientas estadísticas, los más apropiados.
Se han desarrollado varios algoritmos estadísticos que detectan qué gen o genes son los más apropiados para la normalización de un conjunto de tejidos bajo unas condiciones dadas: algunos, como geNORM o BestKeeper, realizan comparaciones por pares y medias geométricas sobre una matriz de expresión de genes de referencia para diversos tejidos.
A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier momento de la amplificación mediante la señal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel sobre un umbral). Los valores de fluorescencia, expresados como logaritmos para estudiar fácilmente la fase exponencial de amplificación, aparecen como una línea recta al representarlos gráficamente frente al número de ciclo; este segmento, denominado segmento cuantificable, permite valorar la cantidad de ADN inicial.
Las cinéticas de tres PCR de tres muestras distintas (K, L y M) de concentraciones de ADN inicial decrecientes (concretamente, se reducen a la décima parte cada vez) se representan en un gráfico semilogarítimo de fluorescencia (en ordenadas) frente al ciclo de PCR (en abscisas). No se representan las fases previas a la exponencial.
Como se indicaba en el apartado de cuantificación, el empleo del CT como valor matemático permite obtener resultados fiables, pero este hecho puede no ser explotado directamente. A fin de conocer la cantidad de ADN inicial, es preciso pues realizar nuevas transformaciones matemáticas que requieren conocer la eficiencia de PCR, que suele determinarse gracias a una recta de calibrado.
Las nuevas muestras F, G, H, I, J, K, L, M y N, de concentración de ADN inicial decreciente (un orden de magnitud cada vez) son amplificadas mediante PCR en un mismo experimento. Cada cinética permite determinar un CT para cada uno (es decir, un número en referencia a un ciclo en concreto). Se representan las concentraciones de ADN como número de moléculas por tubo (en este caso, F posee 70 millones y N, 0,7).
Los rendimientos representados corresponden a «n» reacciones, cuya fiabilidad se debe a la existencia de réplicas independientes en la reacción, personal y reactivos. La fluorescencia se muestra en unidades arbitrarias y el ruido de fondo ha sido limpiado. Cabe destacar que la muestra Nn no ha amplificado en absoluto.
Los valores CT medios en función de la cantidad de ADN inicial de todas las réplicas pueden representarse en un gráfico semilogarítmico. De este modo, la recta de calibrado para estos valores medios puede definirse gracias a una regresión lineal con un determinado coeficiente de correlación (r2) que, para ser considerado de calidad, debe poseer un valor mínimo de 0,9999. No obstante, han de representarse los errores, generalmente definidos según el rango de valores obtenidos para un punto.
Con estos datos, es posible estudiar:
Luego la recta de calibrado permite una cuantificación para un protocolo experimental dado pero hay que tener en cuenta que existen multitud de fuentes de error potenciales, como diferencias de composición química del tampón de reacción, de las muestras (presencia de proteínas, ARN, etc.) e incluso del diluyente (el agua, generalmente).
Como se indicaba anteriormente, es posible cuantificar la expresión génica tanto en términos absolutos como en relativos (es decir, por comparación con la expresión de otro gen). En el segundo caso, es de vital importancia seleccionar como gen estándar aquel cuya expresión realmente no varíe cuando se somete al individuo al tratamiento experimental cuyo efecto en la transcripción se desea estudiar (por ejemplo, un estrés ambiental, biótico o tipo de tejido).
Se basa en las características de la fase exponencial de la curva sigmoide de emisión de fluorescencia. Responde a la ecuación:
donde Q es la cantidad de ADN, n corresponde al número de ciclo, o es el ciclo de partida y E la eficiencia de la reacción.
En el ciclo en el que se sobrepasa el nivel umbral (esto es, el CT), se dice que:
(1)
Establece una relación R entre la cantidad de ADN inicial de una muestra respecto de la de un testigo, que se asume que se expresa de forma invariable e independiente del tratamiento. En su detección tenemos que:
o:
Desde 2002 existe una tendencia a emplear varios genes normalizadores para realizar una cuantificación relativa fiable; de este modo, se generan factores de normalización que ponderan de algún modo el impacto de cada gen interno; una aproximación común se basa en el empleo de medias geométricas de estos genes normalizadores.
El análisis estadístico que permite la detección de los genes expresados de forma más estable en la serie de tejidos estudiada es crucial, puesto que de él depende la elección de los genes que se emplearán como control interno durante los ensayos de cuantificación relativa. Con el fin de evaluar esta estabilidad, en algunos casos se comparan sus valores CT; en otros, sus cantidades relativas empleando la muestra cuyo CT es menor como elemento normalizador.
Como primera aproximación, el algoritmo geNorm permite el cálculo de un valor de estabilidad M inversamente proporcional a la estabilidad del gen en cuestión, y de una serie de valores "PV" que definen el número mínimo de genes adecuado para efectuar una normalización fiable. El cómputo de valor M se basa en definir la variación media, calculada comparando pares dos a dos, de un gen frente a todos los demás genes presentes en el estudio. El algoritmo se realiza en varios pasos, ya que en cada ronda de comparaciones se suprime el gen que ha obtenido un peor valor; de este modo, es capaz de adjudicar un valor M a cada gen salvo para los más estables, que comparten el mismo. En cuanto a valores PV, su cómputo se basa en el diseño de un factor de normalización óptimo; al principio, este se realiza con los dos genes más estables pero, secuencialmente, se le van añadiendo otros hasta que dicha adición no mejora significativamente la precisión de aquel. Así, se define un valor PV para las comparaciones entre Vn/n+1, estimado como la desviación estándar de las ratios transformadas logarítmicamente de .
Otro algoritmo, denominado NormFinder, aprovecha los valores CT para ajustar un modelo matemático de la expresión génica capaz de evaluar las variaciones presentes dentro y entre grupos (tipo de órganos, tratamientos químicos... ) definidos por el investigador. De este modo, los genes con una variación inter e intragrupo mínima son los considerados más estables, con un valor de estabilidad S mínimo.
También es posible evaluar no ya la estabilidad mediante comparaciones dos a dos, sino analizar el coeficiente de variación de los niveles de expresión relativos normalizados. Esta aproximación, propia de qBase o qBasePlus, requiere la transformación de los valores CT iniciales en cantidades relativas, teniendo en cuenta los valores de eficiencia de la PCR y empleando como calibrador el gen con menor CT; tras ello, se calcula un factor de normalización para cada muestra empleando la media geométrica de los valores relativos estimados para todos los genes candidatos.
Se deben realizar varios tipos de controles:
La PCR en tiempo real puede realizarse marcando de manera fluorescente oligonucleótidos que detectan específicamente la aparición del producto deseado. El fundamento de esta técnica se basa en el empleo del FRET o transferencia de energía de resonancia de Förster, que es un mecanismo de transferencia de energía entre cromóforos. EL FRET se fundamenta en que la excitación de un cromóforo puede transferirse a otro cercano, generalmente cuando ambos se sitúan en la misma molécula, mediante un mecanismo acoplador dipolo-dipolo. En el caso de que los cromóforos sean fluorescentes (esto es, fluorocromos), el mecanismo subyacente continúa siendo el mismo: la energía se transfiere, lo que desemboca en la aparición de fluorescencia (cabe destacar que no es la fluorescencia la transferida) Las sondas empleadas en PCR a tiempo real existentes son:
Si bien el uso más ampliamente difundido de la Q-PCR consiste en la evaluación de la expresión génica de genes concretos de forma relativa (empleando ARNm de la muestra y retrotranscribiéndolo a ADNc, que se mide mediante esta técnica), se han desarrollado otras aplicaciones fuera del entorno puramente académico. Las aplicaciones de impacto en la industria incluyen la cuantificación de carga microbiana en alimentos o en material vegetal, la detección de OGM (organismos genéticamente modificados) y la cuantificación y genotipado de patógenos virales en humanos.
La PCR cuantitativa se utiliza para el diagnóstico de enfermedades, tales como enfermedades infecciosas, cáncer y anormalidades genéticas. La introducción de ensayos de PCR cuantitativa en laboratorios de microbiología ha mejorado el diagnóstico de enfermedades infecciosas y se utiliza además como herramienta para detectar nuevas enfermedades emergentes.
La Q-PCR es utilizada también por microbiólogos en el campo de seguridad y deterioro de los alimentos, riesgo microbiológico en la calidad del agua y en la protección de la salud pública.
En el campo de la investigación, la PCR cuantitativa se utiliza mayormente para mediciones cuantitativas de la transcripción y expresión génica, determinando como cambia la expresión de un gen concreto a lo largo del tiempo o en determinadas condiciones como la administración de un fármaco, y analizando la respuesta de las células de un tejido al mismo, además del progreso de la diferenciación celular o respuestas frente a cambios en las condiciones ambientales. También se utiliza para determinar la cigosidad de animales transgénicos utilizados en investigación, es decir, determinar la homocigosis o heterocigosis de un individuo para un determinado gen.
La producción de propágulos vegetales o plántulas libres de patógenos es una constante en la industria agronómica por cuestiones económicas y sanitarias. Para el caso de Phytophthora ramorum, un hongo que causa muerte súbita en robles y otras especies, se han desarrollado sistemas basados en sondas Taqman capaces de detectar una cantidad de 10 a 100 fg mezclados en el ADN de la planta hospedadora. La discriminación entre el ADN del patógeno y de la planta se hace amplificando secuencias espaciadoras transcritas internas (ITS), unos espaciadores situados en la zona codificante de los genes de ARN ribosomal característicos para cada taxón. Existen variantes con sondas Scorpion, Molecular Beacon y LAMP para el mismo patógeno que, además, pueden ser aplicadas en campo.
La Q-PCR (precedida de retrotranscripción) se emplea en la detección de OGM debido a la alta sensibilidad y rango dinámico de detección de ADN; sus alternativas, como son el análisis del ADN o de las proteínas, suelen mostrar menos sensibilidad. Para ello se emplean cebadores específicos que amplifiquen no ya el propio transgén, sino su promotor, terminador e incluso sus secuencias intermedias, empleadas durante el proceso de ingeniería del vector. Además, puesto que el proceso de creación de una planta transgénica suele conducir a la inserción de más de una copia del transgén, debe evaluarse su cantidad; para ello se efectúa una cuantificación relativa empleando como gen control uno propio de la especie tratada, que se encuentre en copia única.
Las virosis en humanos pueden ser debidas a infecciones por parte de patógenos concretos o a coinfecciones, y este hecho no solo puede dificultar el diagnóstico mediante las técnicas clásicas, sino que puede redundar en un pronóstico diferente y en la necesidad de emplear una u otra quimioterapia. El empleo de la Q-PCR posibilita tanto la cuantificación como el genotipado (caracterización de la cepa, que se hace mediante curvas de melting) de virus como el HBV (virus de la hepatitis B). El grado de infección, cuantificado como las copias de genoma viral por unidad de tejido del paciente, es relevante en muchos casos. Por ejemplo, la probabilidad de que el virus del herpes simple de tipo 1 se reactive está relacionada con el número de neuronas infectadas en los ganglios. Esta cuantificación se realiza con retrotranscripción o sin ella, en el caso de que los virus se integren en el genoma humano en algún momento de su ciclo, como en el caso del HPV (virus del papiloma humano), alguna de cuyas variantes está asociada con la aparición de cáncer de cérvix.