Las células madre pluripotentes inducidas (normalmente abreviadas como células iPS, por sus siglas en inglés: "induced Pluripotent Stem" ) son un tipo de células madre con características pluripotenciales (capaces de generar la mayoría de los tejidos) derivadas artificialmente de una célula que inicialmente no era pluripotencial. Por lo general se utiliza como una célula adulta diferenciada (diferenciación celular) procedente de un tejido, sobre la que se induce la expresión de varios genes exógenos, tales como Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4, capaces de des-diferenciarla. Se denomina reprogramación a esta desdiferenciación. Las células iPS son capaces: a) de diferenciarse en células de tejidos pertenecientes a las tres capas germinales de un embrión natural (ver embriogénesis humana): endodermo, mesodermo y ectodermo, b) de formar teratomas, y c) ratones quiméricos o quimeras (quimerismo).
Se ha demostrado que las células iPS son idénticas en muchos aspectos, y similares en otros, a las células madre embrionarias (normalmente abreviadas como ES, por sus siglas en inglés: "Embryonic Stem"). Por ejemplo, son iguales en morfología, expresión de ciertos genes y proteínas, patrones de metilación del ADN, tiempo de duplicación celular y capacidad de diferenciación a células de otros tejidos. Sin embargo, el mecanismo mediante el cual se inducen y su relación con las células ES sigue aún en investigación (Liu, et al. 2011).
Las células iPS se obtuvieron por primera vez en el año 2006 a partir de células de ratones (Takahashi & Yamanaka, 2006), y en 2007 a partir de células humanas (Takahashi, et al. 2007). En 2006, se describió por primera vez este proceso a partir de fibroblastos de ratón utilizando retrovirus que vehiculizaban e inducían la expresión de varios genes exógenos. En 2011 se publicó una revisión sobre esta primera metodología (Miller & Schlaeger, 2011). Este logro se considera uno de los avances más importantes de la investigación con células madre, ya que permite obtener células madres pluripotenciales a partir de células adultas. Las iPS tienen aplicaciones como modelos para estudio de enfermedades, posibles usos terapéuticos (disminuyendo el rechazo en los trasplantes y sin la controversia del uso de embriones que tiene las células ES), y en investigaciones básicas.
Shinya Yamanaka y John Gurdon fueron galardonados en 2012 con el premio nobel de Fisiología o Medicina.
Las células iPS se derivan de células adultas por transferencia (transfección) de varios genes exógenos asociados a células ES. Generalmente para una transferencia eficiente se utilizan retrovirus que actúan como vehículos o vectores de los genes exógenos. Los genes exógenos transferidos son principalmente los correspondientes a factores de transcripción (transcripción genética) asociados a las células ES. Después de 3–4 semanas , un pequeño porcentaje de las células transferidas comienzan a diferenciarse volviéndose morfológica y bioquímicamente similares a las células ES. Las células iPS o células adultas reprogramadas se aíslan por selección con un gen de resistencia a antibióticos y por confirmación de su identidad (ver después).
El equipo de Shinya Yamanaka en la Universidad de Kioto (Japón) en 2006, fue el primero en generar células iPS. Para ello usaron como células diana fibroblastos de ratón, como genes exógenos los previamente identificados como expresados en las células ES, y como vehículos o vectores los retrovirus. Cuatro genes codificando factores de transcripción resultaron esenciales para producir células iPS: los denominados Oct-3/4, Sox2, c-Myc, y Klf4. De las células tratadas con retrovirus codificando dichos genes se seleccionaron aquellas que los expresaban con antibióticos y por la presencia del gen Fbx15(células Fbx15+) . Sin embargo estas células iPS tenían patrones de metilación del ADN distintos de los de las células ES y además no producían ratones quiméricos viables.
En 2007, el mismo grupo publicó un trabajo junto con otros grupos de investigación independients de Harvard, MIT, y la Universidad de California, que demostraba que se podían obtener células iPS a partir de fibroblastos de ratón con capacidad de formar quimeras viables utilizando el gen Nanog en vez del Fbx15. Los patrones de metilación de DNA y la producción de ratones quiméricos viables indicaron que Nanog es un determinante importante de la pluripotencia celular (Maherali, et al. 2007, Okita, et al. 2007, Takahashi &Yamanaka, 2006, Wernig, et al. 2007). Desafortunadamente, debido a que uno de los cuatro genes utilizados (c-Myc) es oncogénico, el 20% de los ratones quiméricos desarrolló cáncer. En un estudio posterior, se demostró que se pueden mantener células iPS sin c-Myc que no desarrollen cáncer, pero el procedimento es menos eficiente (Nakagawa, et al. 2008).
En 2007, también se publicó el avance más importante, ya que se habían podido generar células iPS humanas a partir de células humanas adultas. Los resultados se obtuvieron por dos equipos de investigación independientes. Uno dirigido por Yamanaka en Japón transformó fibroblastos humanos en células iPS utilizando los genes: Oct3/4, Sox2, Klf4, y c-Myc vehiculizados en retrovirus (Takahashi, et al. 2007), mientras otro por Thomson en USA usó los genes Oct4, Sox2, Nanog, y LIN28 vehiculizados en lentivirus (Yu, et al. 2007).
Aunque los primeros métodos utilizando genes codificadores de factores de transcripción demostraron que las células adultas diferenciadas se pueden reprogramar a células iPS, todavía existen problemas importantes, tales como i) eficiencia, ii) mutagénesis insercional, iii) tumores y iv) reprogramación incompleta.
Para que un método de reprogramación sea práctico o incluso viable, las eficiencias o porcentajes de reprogramación (número de células reprogramadas respecto al total de células adultas diana iniciales) deben ser lo más altas posible. Por ejemplo, una eficiencia de reprogramación del 50-100 % sería óptima, pero los primeros porcentajes de reprogramación estaban en el 0,1-1% (Takahashi &Yamanaka, 2006). Las eficiencias de reprogramación dependen mayoritariamente de los vectores que se utilicen (Takahashi & Yamanaka, 2006). Los riesgos para el uso de células iPS en humanos también dependen en gran medida de los métodos utilizados. Aunque las transferencias con retrovirus son hasta ahora las que han obtenido una mayor eficiencia, dan lugar a la inserción al azar de los genes exógenos en el genoma de la célula diana, lo que puede producir mutagénesis insercional provocando inactivación de genes vitales o activación de oncogenes (Zhang, et al. 2011). Hasta ahora las alternativas a estas metodologías son: i) Compuestos de bajo peso molecular, ii) Adenovirus, plásmidos y transposones, iii) Proteínas recombinates y iv) Móleculas ARN. Mejoras en estas nuevas metodologías que dieran lugar a mayores eficiencias podrían ayudar a generar células iPS más seguras y a encontrar soluciones a estos problemas. Quizá haya que diseñar nuevos métodos que combinen todas las ventajas conocidas.
Una de las principales estrategias para evitar la mutagénesis insercional es el uso de moléculas de bajo peso molecular (comparado con las proteínas o los ADNs) como sustitutivos de los efectos de los factores de transcripción. Estas moléculas pueden incrementar la eficiencia de reprogramación compensando el efecto del factor reprogramador. Debido a que no son ADN, dichas moléculas también evitan la integración genómica aumentando así la seguridad. Aunque aún no se ha podido identificar una mezcla de moléculas que completamente reprograme las células adultas a pluripotentes, existen algunos ejemplos que aumentan la eficiencia o incluso pueden substituir algunos de los genes.
Los primeros estudios describiendo algunas de estas estrategias se realizaron en 2008. Por ejemplo, el ácido valproico, un inhibidor de la diacetilasa de las histonas, aunmentó la eficiencia de reprogramación unas 100 veces (Huangfu, et al. 2008). Se supone que el ácido valproico simula las señales del factor de transcripción c-Myc. Un tipo similar de mecanismo se ha propuesto para el BIX-01294, un inhibidor de la metiltransferasa de histonas que simula los efectos del Sox2 (Shi, et al. 2008) . La simulación de otras señales es un tema de activa investigación (Chen, et al. 2011).
Otra estrategia se basó en el estudio de la ruta molecular natural de diferenciación de las células mesenquimales a epiteliales en la que intervienen TGFb (Factor de Transformación beta) y MEK (Kinasa de proteínas Epiteliales activada por Mitógenos). Primero se seleccionaron dos inhibidores de TGFb y MEK entre aquellos que no solo inhibían la diferenciación sino que también eran las más activos en reprogramación (SB431412 y PD0325901). Cuando se usaron estos dos inhibidores en combinación, aumentaron unas 100 veces la eficiencia de reprogramación. Después se investigó de una manera similar, la ruta molecular natural empleada para mantener la supervivencia celular. Así, después de ensayar en reprogramación varios compuestos que inhiben dicha ruta, se seleccionó el Thiazovivin. Usando una mezcla de estos 3 inhibidores se consiguió una mejora en la eficiencia de reprogramación de unas 200 veces (Lin, et al. 2009).
Por otra parte, el estudio de los mecanismos de reprogramación posiblemente aportará nuevas alternativas e ideas sobre este importante tema (Lin, 2011, Lin, et al. 2011).
Otra estrategia para evitar la formación de tumores ha sido el uso de vectores alternativos o no retrovirales, tales como los: adenovirus, plásmidos y transposones. Sin embargo, aunque los métodos basados en todos estos vectores alternativos evitan el uso de retrovirus, todavía requieren el uso de genes exógenos provocadores de tumores para obtener reprogramación.
Los adenovirus son únicos entre los vectores virales porque no incorporan ninguno de sus propios genes al genoma de la célula diana y por lo tanto evitan la mutagénesis insercional (Zhou &Freed, 2009). Otra ventaja de usar adenovirus es que solo necesitan estar presentes durante un breve tiempo para inducir la reprogramación. En 2008, se usó un adenovirus para vehiculizar los cuatro genes exógenos (factores de transcripción) a células de ratones obteniendo células idénticas a las ES (Stadtfeld, et al. 2008), demostrándose así que para obtener células iPS no es absolutamente necesaria la integración en el genoma de la célula diana de los genes exógenos.
En 2008, el equipo de Yamanaka demostró que la reprogramación también era posible empleando plásmidos en vez de retrovirus para transferir los cuatro genes exógenos (Okita, et al. 2010). En dichos trabajos, se describe cómo fueron capaces de transformar células de ratón con dos plásmidos, uno de ellos expresaba el c-Myc, mientras que el segundo expresaba Oct4, Klf4, y Sox2. Sin embargo, estos métodos son mucho menos eficientes que los basados en retrovirus y también tienen posibilidades de mutagénesis insercional aunque en menor proporción que los retrovirus.
Se ha intentado también el uso de algunos transposones . Por ejemplo, varios estudios han demostrado que los transposones denominados piggyBac pueden efectivamente transportar los genes de reprogramación sin introducir mutaciones indeseables en el genoma de la célula diana ya que efectúan una re-excisión de los genes exógenos evitando la mutagénesis insercional (Woltjen, et al. 2009).
Una gran ventaja de este método es que evita los problemas de mutagénesis insercional, puesto que las proteínas no son ácidos nucleicos y no se pueden insertar en el genoma. En 2009, se demostró la generación de células iPS sin alteración genética de las células adultas originales mediante proteínas vehiculizadas a través de péptidos (Zhou, et al. 2009). Así se pudo demostrar que las proteínas recombinantes correspondientes a los factores de transcripción se podían usar para la reprogramación (Zhou, et al. 2009). Mientras que la transferencia de proteínas también induce pluripotencia, el método es más complicado y requiere dominar las técnicas de producción y purificación de proteínas recombinantes. Además, su eficiencia es muy baja.
Los micro ARNs son moléculas cortas complementarias a secuencias de ARN mensajero (ARNm) que bloquean su traducción a proteínas, inhibiendo específicamente la expressión final de los genes. La expresión de moléculas micro ARN específicas de ES (tales como miR-291, miR-294 y miR-295) aumentaban la eficiencia de la reprogramación hasta un nivel similar al método que usa proteínas (Morrissey, et al. 2005). Los micro ARNs quizá actúan bloqueando la expresión de represores de los cuatro o alguno de los cuatro factores de transcripción de Yamanaka. Un obstáculo para el uso de la reprogramación por ARN es su inestabilidad. Sin embargo, se podrían usar ARNs con modificaciones estabilizadoras (5-metilguanosinas o pseudouracilos), que además de ser más estables y tienen menor probabilidad de mutagénesis insercional. Otro obstáculo quizá más importante, es que los ARN exógenos provocan respuestas anti-virales innatas en las células diana.
La generación de células iPS depende de que los genes adecuados se usen para la inducción de la reprogramación. Hasta ahora se han identificado los Oct-3/4 y varios miembros de la familia Sox (Sox1, Sox2, Sox3, Sox15) como genes indispensables para inducir la reprogramación. Por otra parte, genes tales como los de las familias de los factores Kruppel (Klf1, Klf2, Klf4, Klf5), Myc (c-myc, L-myc, N-myc), Nanog, y LIN28, se han identificado como genes implicados en aumentar la eficiencia de reprogramación. Más en detalle:
Las células iPS son muy similares a las células ES tanto en ratón como humanas en los siguientes aspectos: propiedades celulares, pluripotencia y reprogramación epigenética. El estudio de estos aspectos se emplea para confirmar si unas determinadas células iPS son pluripotenciales o no.
Las células iPS se están aplicando al estudio de enfermedades genéticas humanas: i) como modelos in vitro de enfermedades para desarrollar medicamentos específicos, ii) considerando su uso como posible tratamiento individual en medicina regenerativa y iii) utilizándolas para investigación básica. Para adelantarse a estas posibles aplicaciones , ya se ha comenzado a estudiar la organización de bancos de células madres (Taylor, et al. 2011).
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