Actividad enzimática

Los ensayos enzimáticos son métodos de ensayo químico para medir actividades enzimáticas. Son vitales para el estudio de las cinéticas enzimáticas y la inhibición enzimática.

Las cantidades de enzima pueden ser expresadas en moles, como las de cualquier otro compuesto químico, o pueden ser cuantificadas en términos de actividad enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del nivel de actividad de la misma, por lo que la medida de la actividad es dependiente de las condiciones, que deben ser especificadas cuando se dan valores de actividad. La actividad expresa la cantidad de sustrato convertido por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción.

En el Sistema Internacional de Unidades la unidad para la actividad catalítica es el katal (kat), pero es una unidad demasiado grande y suele usarse la unidad de actividad enzimática (UI).

Otra unidad comúnmente usada es la actividad específica. Ésta se refiere a la actividad de una enzima por miligramo (mg) de proteína, y se suele expresar en: μmol x min^-1 x mg^-1). La actividad específica da una idea de la pureza de la enzima.

Todos los ensayos enzimáticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un tiempo. Existe un gran número de métodos diferentes para medir la concentración de sustratos y productos, y muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras. Habitualmente en bioquímica se estudian las reacciones catalizadas por enzima usando cuatro tipos de experimentos:^[1]​

Los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos grupos según la manera en que se sigue la medición. Por una parte están los ensayos continuos, en los que el método ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. Por otra parte existen ensayos discontinuos, en los que la reacción se detiene en un punto y se mide la concentración de los sustratos o los productos.

Son los más convenientes, al obtener simplemente con el ensayo la velocidad de la reacción, sin necesitar trabajo adicional. Hay muchos tipos diferentes.

En los ensayos espectrofotométricos puede seguirse el curso de una reacción observando cómo cambia la luz absorbida por la solución en la que se está dando la reacción. Para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la única molécula de la mezcla de reacción que lo hace a la misma; de esta forma, se puede observar el aumento o la disminución de la absorbancia a dicha longitud de onda.

Cuando la luz absorbida se encuentra en el espectro visible es posible observar un cambio en el color de la muestra, y entonces hablamos de método colorimétrico.

También es usual el uso de la luz ultravioleta (luz UV), especialmente porque sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADPH, coenzimas que participan en infinidad de reacciones bioquímicas y que absorben luz UV en forma reducida (NADH y NADPH) pero no en forma oxidada (NAD⁺ y NADP⁺). Así, la actividad de una oxidorreductasa que use NADH como coenzima puede ser monitorizada siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume el NADH.^[2]​

Ensayos directos y acoplados

Incluso cuando la reacción enzimática a estudiar no provoca ningún cambio de absorbancia o ésta no es específica, pueden usarse ensayo espectrofotométricos para la enzima realizando un ensayo acoplado. En este, el producto de la reacción a estudiar se usa como sustrato de una segunda reacción, que ha de ser de fácil seguimiento y cuyos otros sustratos, coenzimas y enzimas deben encontrarse a concentraciones saturantes para que la velocidad de la segunda reacción sea la máxima. Por ejemplo, en la figura 1 puede verse el esquema de un ensayo acoplado para la hexoquinasa, que puede medirse acoplando la producción de glucosa-6-fosfato a la producción de NADPH usando la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

En el fenómeno de la fluorescencia una molécula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. Los ensayos fluorimétricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reacción enzimática. Estos ensayos son generalmente mucho más sensibles que los espectrométricos, ya que son más específicos al tener que utilizar dos longitudes de onda en lugar de una, pero pueden sufrir más interferencias por impurezas presentes en el medio o por la inestabilidad que muchos compuestos fluorescenten presentan al ser expuestos a la luz.

Un ejemplo de estos ensayos es, una vez más, el uso de las coenzimas NADH y NADPH. En este caso, las formas reducidas son fluorescentes y las oxidadas no. Las reacciones de oxidación pueden, por tanto, ser seguidas por el descenso de la intensidad de fluorescencia, y las de reducción por el aumento.^[3]​ También existen sustratos sintéticos que liberan un fluoróforo en reacciones catalizadas por enzima, como por ejemplo el 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido para ensayar la β-galactosidasa.

La calorimetría es la medida del calor liberado o absorbido por una reacción química. Estos ensayos son muy generales, ya que muchísimas reacciones llevan asociado algún cambio de calor y utilizando un microcalorímetro no es necesario utilizar grandes cantidades de enzima o sustrato. Estos ensayos pueden ser usados para medir reacciones imposibles de medir con otros métodos.^[4]​

La quimioluminiscencia es la emisión de luz por una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y ésta puede ser medida para detectar la formación de producto. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida puede ser registrada en una película fotográfica por días e incluso semanas, pero al mismo tiempo son de difícil cuantificación, porque no toda la luz emitida por la reacción será detectada.

La detección de la peroxidasa de rábano por quimioluminiscencia enzimática (ECL, enzymatic chemiluminiscence) es un método común para detectar anticuerpos en el western blot. Otro ejemplo de quimioluminiscencia es la luciferasa, enzima presente en las luciérnagas que produce luz de forma natural a partir de su sustrato, luciferina.

En un ensayo discontinuo se toman muestras de una reacción enzimática en intervalos y se mide en ellas la cantidad de producto formado o sustrato consumido.

En los ensayos radiométricos se mide la incorporación de radiactividad en los sustratos o su liberación desde sustratos. Los radioisótopos más usados en estos ensayos son ¹⁴C, ³²P, ³⁵S y ¹²⁵I. Como los isótopos radiactivos permiten el marcaje de un solo átomo de un sustrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. Son frecuentemente utilizados en bioquímica y son a menudo la única manera de medir una reacción específica en extractos crudos (mezclas complejas de las enzimas liberadas al lisar células).

En estos procedimientos la radiactividad es normalmente medida en contadores de centelleo.

En los ensayos cromatográficos se mide la formación de producto separando los componentes de la mezcla de reacción por cromatografía. Normalmente, se lleva a cabo mediante HPLC. Aunque esta aproximación puede requerir grandes cantidades de material de partida, su sensibilidad puede incrementarse mediante marcaje radiactivo de los sustratos o los productos.

Ensayo de actividad enzimática