El cinetocoro es una estructura proteica situada sobre los cromosomas superiores. Sobre esta estructura se anclan los microtúbulos (MT) del huso mitótico durante los procesos de división celular (meiosis y mitosis). El cinetocoro está localizado en una zona específica del cromosoma, el centrómero. En vertebrados y levaduras los cinetocoros son estructuras discretas y únicas en cada cromosoma, pero existen organismos (como C. elegans) que presentan cinetocoros difusos a lo largo de los brazos cromosómicos: son los denominados cromosomas holocéntricos.
Los cinetocoros inician, controlan y supervisan los llamativos movimientos de los cromosomas durante la división celular. En cuanto a su estructura, los cinetocoros de las células animales pueden subdividirse en dos regiones:
Las funciones del cinetocoro incluyen el anclaje de los cromosomas a los MT del huso mitótico, la verificación de esos anclajes, la activación del checkpoint de mitosis (un mecanismo de control que retrasa la salida de mitosis si se detectan fallos) y la participación en la generación de las fuerzas que propulsan los movimientos cromosómicos durante la división celular.
Los microtúbulos son polímeros metaestables de tubulina-α y β que alternan entre fases de crecimiento y despolimerización, un fenómeno que se conoce como "inestabilidad dinámica". La naturaleza enormemente dinámica del comportamiento de los MT está integrada con la función de los cinetocoros para mover y segregar los cromosomas.
El cinetocoro está compuesto de distintas capas, que se observaron inicialmente por métodos convencionales de fijación y teñido de microscopía electrónica (revisado por C. Rieder en 1982), y más recientemente por congelación rápida y sustitución.
La capa más profunda del cinetocoro es la lámina interna, que se organiza sobre una estructura de cromatina que contiene nucleosomas que presentan una histona especializada (CENP-A, que sustituye a la histona H3 en esta zona), proteínas auxiliares y ADN. La organización de este ADN es uno de los aspectos más desconocidos del cinetocoro de vertebrados. La placa interna aparece como un dominio de heterocromatina discreto a través de todo el ciclo celular. Por fuera de esta aparece la placa externa, compuesta sobre todo de proteínas. Esta estructura se forma en la superficie de los cromosomas en el momento de la ruptura de la envoltura nuclear. La placa externa de los cinetocoros de vertebrados tiene alrededor de 20 sitios de anclaje para extremos (+) de microtúbulos (denominados kMT, por kinetochore MT), mientras que la placa externa de los cinetocoros de Saccharomyces cerevisiae tiene un solo sitio de anclaje. La zona más externa del cinetocoro forma una corona fibrosa que puede visualizarse por microscopía convencional, pero solo en ausencia de MT. Esta corona está formada por una red dinámica de proteínas residentes y temporales que están implicadas en el checkpoint de mitosis, en el anclaje de MT y en la regulación del comportamiento de estos.
Durante mitosis, cada una de las dos cromátidas hermanas que forman el cromosoma completo presenta su propio cinetocoro. Los cinetocoros hermanos distintos se observan por primera vez al final de la fase G2 en células cultivadas de mamíferos. Estos cinetocoros tempranos presentan una estructura laminar madura antes de la ruptura de la envoltura nuclear (revisado por Pluta y colaboradores en 1995). La ruta molecular del ensamblaje de los cinetocoros de los eucariotas superiores se ha estudiado utilizando knockouts de genes en ratones y en células de pollo en cultivo, así como técnicas de ARN interferente (RNAi) en C. elegans, Drosophila y células humanas. Sin embargo, ninguna ruta lineal simple puede describir los datos obtenidos.
La primera proteína que se ensambla en el cinetocoro es CENP-A (Cse4 en Saccharomyces cerevisiae). Esta proteína es una isoforma especializada de la histona H3. CENP-A es necesaria para la incorporación de las proteínas del cinetocoro interno CENP-C, CENP-H y CENP-I/MIS6. Las posiciones relativas de estas proteínas en la ruta dependiente de CENP-A no están completamente claras. Por ejemplo, la localización de CENP-C requiere CENP-H en células de pollo, pero es independiente de CENP-I/MIS6 en células humanas. En C. elegans y en metazoos, la incorporación de muchas proteínas del cinetocoro externo depende en último término de CENP-A.
Los componentes del cinetocoro pueden agruparse en función de su localización a través del ciclo celular. Los componentes constitutivos, como CENP-A, CENP-C, CENP-H y CENP-I, están unidos a la cromatina asociada al cinetocoro durante todo el ciclo, mientras que otros componentes solo se asocian al cinetocoro al comenzar la profase.
Las proteínas del cinetocoro también pueden agruparse en función de si su concentración cinetocórica permanece constante o varía durante mitosis, y si se reciclan de forma lenta (son estables) o rápida (dinámicas) en sus sitios de unión en los cinetocoros.
Un estudio del 2010 utiliza un método complejo (denominado proteómica combinatoria con clasificadores múltiples o MCCP por las siglas en inglés de multiclassifier combinatorial proteomics) para analizar la composición proteica de los cromosomas completos de vertebrados, incluyendo el cinetocoro. Aunque este estudio no incluye un proceso bioquímico de enriquecimiento en cinetocoros, los datos obtenidos incluyen todos los sub-complejos centroméricos, con péptidos procedentes de 125 proteínas centroméricas conocidas. Según este estudio, aún se desconocen del orden de un centenar de proteínas asociadas al cinetocoro, lo que dobla la complejidad de la estructura conocida durante la mitosis, confirmando que el cinetocoro es una de las sub-estructuras más complejas de la célula.
El número de microtúbulos que se unen a un cinetocoro es variable: en Saccharomyces cerevisiae se une al cinetocoro tan solo un microtúbulo, mientras que en mamíferos superiores a cada cinetocoro se unen entre 15 y 35 microtúbulos. Sin embargo, no todos los microtúbulos del huso alcanzan los cinetocoros. Hay microtúbulos que se extienden desde un centrosoma al otro (de los que depende la longitud del huso) y otros más cortos que están interdigitados entre los microtúbulos largos. El profesor B. Nicklas, en la Universidad de Carolina del Norte, demostró que si se rompe la unión entre los microtúbulos y los cinetocoros mediante un rayo láser, las cromátidas no pueden moverse, produciéndose una distribución anormal de los cromosomas. Estos experimentos demostraron también que el cinetocoro tiene polaridad y que su interacción con los microtúbulos de uno u otro centrosoma dependerá de su orientación. Esta especificidad garantiza que solamente una de las cromátidas se mueva hacia cada lado del huso, asegurando la distribución adecuada del material genético. Una de las funciones básicas del cinetocoro es, por tanto, el anclaje a los microtúbulos del huso, que es fundamental para realizar una correcta segregación de cromátidas. Si el anclaje se produce de forma incorrecta, se pueden producir errores que generen situaciones de aneuploidía, con drásticas consecuencias para la célula. Para evitarlo, existen mecanismos de detección y corrección de errores (como el checkpoint de mitosis), cuyos componentes también residen en los cinetocoros. El desplazamiento de una cromátida hacia el centrosoma se produce fundamentalmente por despolimerización de los microtúbulos en el sitio de unión con el cinetocoro. Dichos desplazamientos precisan además la generación de fuerzas en las que intervienen motores moleculares localizados asimismo en los cinetocoros.
Durante la fase de síntesis (fase S) del ciclo celular, el centrosoma comienza a duplicarse. Justo al inicio de mitosis, ambos centriolos de cada centrosoma alcanzan su longitud máxima, los centrosomas reclutan material adicional y su capacidad de nucleación de microtúbulos aumenta. A medida que progresa la mitosis, ambos centrosomas se separan para establecer el huso mitótico. De esta forma, el huso de una célula mitótica tiene dos polos que emanan microtúbulos. Los microtúbulos son largos filamentos proteicos con dos extremos asimétricos, un extremo "menos" (-) relativamente estable cercano al centrosoma, y un extremo "más" (+) que sufre fases alternadas de crecimiento-retroceso y que explora el centro celular. En este proceso de búsqueda, un microtúbulo puede localizar y capturar un cromosoma. Los microtúbulos que localizan un cinetocoro se estabilizan, mientras que aquellos que no lo encuentran se despolimerizan rápidamente. Como los cromosomas presentan dos cinetocoros asociados espalda-con-espalda (uno en cada cromátida hermana), cuando uno de ellos se engancha a los microtúbulos generado por uno de los polos celulares, el cinetocoro de la cromátida hermana queda expuesto hacia el otro polo celular, por lo que en la mayor parte de los casos el segundo cinetocoro se asocia a los microtúbulos del polo opuesto, de manera que los cromosomas quedan « bi-orientados», una configuración fundamental (también denominada anfitélica) para asegurar que la segregación tendrá lugar de manera correcta cuando la célula se divida.
En el momento en que un solo microtúbulo se ancla a un cinetocoro, se inicia un rápido movimiento del cromosoma asociado en dirección al polo del que procede dicho microtúbulo. Este movimiento está probablemente mediado por la actividad motora dirigida hacia el extremo (-) de la proteína motora dineína citoplásmica, que se encuentra muy concentrada en los cinetocoros sin anclar (revisado por Banks y Heald en 2001). El movimiento hacia el polo se ralentiza a medida que los cinetocoros adquieren kMT (MT anclados a cinetocoros) y el movimiento pasa a ser dirigido por cambios en la longitud de los kMT. La dineína se libera de los cinetocoros a medida que éstos adquieren kMT y, en células en cultivo de mamíferos, es necesaria para la inactivación del checkpoint de mitosis, pero no para el alineamiento cromosómico en el ecuador del huso, la adquisición de kMT o la anafase A durante la segregación cromosómica. En plantas superiores o en levaduras no hay evidencia de existencia de dineína, pero otras kinesinas dirigidas hacia el extremo (-) podrían compensar la falta de dineína.
Otra proteína motora implicada en la captación inicial de MT es CENP-E; ésta es una kinesina de gran tamaño que se asocia con la corona fibrosa de los cinetocoros de mamíferos desde prometafase hasta anafase. En células con niveles bajos de CENP-E, los cromosomas carecen de esta proteína en sus cinetocoros, que a menudo presentan defectos en su capacidad de alinearse. En este caso, algunos cromosomas permanecen crónicamente mono-orientados (anclados a un único polo), incluso aunque la mayoría se congreguen correctamente en la placa metafásica.
En general se acepta ampliamente que la fibra de kMT (el haz de microtúbulos unidos al cinetocoro) se forma originalmente por la captura de MT que se polimerizaron en los centrosomas y polos del huso en células de mamíferos en cultivo. Sin embargo, la polimerización de MT directamente en los cinetocoros podría también contribuir de forma importante. La forma en la cual la región del cinetocoro/centrómero inicia la formación de fibras de kMT y con qué frecuencia ocurre son cuestiones importantes, dado que este mecanismo puede contribuir no solo a la formación inicial de kMT, sino también a cómo los cinetocoros corrigen errores en el anclaje de MT y regulan el movimiento a lo largo de los kMT.
Los MT asociados a cinetocoros presentan unas características especiales: en comparación a los MT no anclados, los kMT son mucho más resistentes a la despolimerización inducida por el frío, las altas presiones hidrostáticas o la exposición al calcio. Además, los kMT se reciclan mucho más despacio que los MT astrales y los MT del huso que tienen extremos (+) libres, y si los kMT se separan de los cinetocoros mediante rayo láser, se despolimerizan rápidamente.
Una vez establecido que dineína y CENP-E no son esenciales para la formación de los kMT, las moléculas responsables de la estabilización de éstos debían de ser otras. Estudios genéticos pioneros en levaduras revelaron la importancia del complejo Ndc80 en el anclaje de los kMT. En Saccharomyces cerevisiae, el complejo Ndc80 tiene cuatro componentes: Ndc80p, Nuf2p, Spc24p y Spc25p. Los mutantes que carecen de alguno de los componentes de este complejo presentan pérdida de la conexión cinetocoro-microtúbulo sin mostrar una pérdida completa de la estructura del cinetocoro. Sin embargo, los mutantes en los que se ha perdido la estructura del cinetocoro (como los mutantes para Ndc10 en levaduras) presentan deficiencias tanto en la conexión con los microtúbulos como en la capacidad de respuesta del checkpoint de mitosis, posiblemente porque los cinetocoros funcionan como una plataforma en la que se organizan los componentes de la respuesta.
El complejo Ndc80 está muy conservado y se ha identificado en S. pombe, C. elegans, Xenopus, pollos y humanos. Estudios realizados con Hec1 (por highly expressed in cancer cells 1), el homólogo de Ndc80p en humanos, han mostrado que es importante para la correcta congregación cromosómica y la progresión a través de mitosis, y que interacciona con componentes de los complejos de cohesinas y condensinas.
Diferentes laboratorios han mostrado que el complejo Ndc80 es crucial para la estabilización de los anclajes cinetocoro-microtúbulo, necesarios para mantener las tensiones centroméricas implicadas en el establecimiento del alineamiento cromosómico correcto en eucariotas superiores. Las células en las que se ha eliminado la función de Ndc80 (mediante RNAi, knockout de genes, o microinyección de anticuerpos) tienen husos mitóticos anormalmente largos, pérdida de tensión entre cinetocoros hermanos, cromosomas que no pueden congregarse en la placa metafásica y pocos o ningún kMT asociados.
Aunque existe alguna evidencia in vitro de que heterodímeros Ndc80p-Nuf2p pueden unirse a microtúbulos, no está claro que in vivo la conexión entre el complejo Ndc80 y los MT sea directa. En levaduras, esta conexión requiere la presencia del complejo Dam1-DASH-DDD. Algunos miembros de este complejo se unen directamente a los MT, mientras que otros se unen al complejo Ndc80. Por tanto, el complejo Dam1-DASH-DDD podría ser un adaptador esencial entre los cinetocoros y los microtúbulos. Sin embargo, en animales no se ha encontrado un complejo equivalente, y esta cuestión permanece bajo intensa investigación.
Cuando una célula entra en mitosis, duplica toda su información genética, en el proceso denominado replicación del ADN. Al final de este proceso, cada cromosoma consta de dos cromátidas hermanas, que son dos moléculas de ADN completas e idénticas. Ambas cromátidas permanecen unidas mediante complejos cohesinas hasta anafase, cuando se produce la segregación cromosómica. Para que ésta se produzca correctamente, cada célula hija debe recibir un juego completo de cromátidas, lo cual quiere decir que cada cromátida hermana (a través de su cinetocoro) debe anclarse a MT procedentes de polos opuestos del huso mitótico. Esta configuración se denomina anfitélica o "bi-orientación".
Sin embargo, durante el proceso de anclaje se producen también configuraciones incorrectas:
Tanto la configuración monotélica como la sintélica generan tensión centromérica y son detectadas por el checkpoint de mitosis, pero la configuración merotélica no se detecta por este mecanismo de control. Sin embargo, la mayor parte de estos errores son detectados y corregidos antes de que la célula entre en anafase. Un factor clave en la corrección de los errores de anclaje es el complejo pasajero de los cromosomas (chromosomal passenger complex), que incluye la proteína kinasa Aurora B, su diana y subunidad activadora INCENP y otras dos subunidades, Survivina y Borealina/Dasra B (véase la revisión de Adams y colaboradores en 2001). En células en las que se ha eliminado la función de este complejo mediante mutantes dominantes-negativos, RNAi, microinyección de anticuerpos o utilización de drogas selectivas, se acumulan errores en el anclaje de los cromosomas. Muchos estudios han mostrado que Aurora B es necesaria para desestabilizar los anclajes cinetocoro-microtúbulo incorrectas, de manera que se favorezca la generación de conexiones anfitélicas. El homólogo de Aurora B en levaduras (Ipl1p) fosforila algunas proteínas del cinetocoro, como la proteína constitutiva Ndc10p y miembros de los complejos Ndc80 y Dam1-DASH-DDD. La fosforilación de los componentes del complejo Ndc80 produce la desestabilización de los anclajes de los kMT. Se ha propuesto que la localización de Aurora B es importante para su función: al encontrarse en la zona interna del cinetocoro (en la heterocromatina centromérica), cuando se establece tensión centromérica los cinetocoros hermanos se alejan, y Aurora B no puede alcanzar sus sustratos, de manera que los kMT se estabilizan. Es interesante notar que Aurora B se encuentra sobreexpresada frecuentemente en varios tipos de tumores y es en la actualidad una diana para el desarrollo de drogas anticancerosas.
El mecanismo que detecta que se ha formado correctamente un huso mitótico, que todos los cromosomas están asociados a dicho huso de manera bipolar, y que todos ellos se encuentran alineados en la placa metafásica es el denominado checkpoint de mitosis o también punto de control del ensamblaje del huso, abreviado SAC por sus siglas en inglés (Spindle Assembly Checkpoint). Cuando alguno de los cromosomas, por alguna razón, se retrasa durante el proceso de alineamiento, esta maquinaria produce una parada temporal de la progresión en el ciclo celular: la célula se detiene, dando tiempo a los mecanismos de reparación a resolver el problema detectado. Si pasado un tiempo, el problema no se ha corregido, la célula será abocada a un proceso de muerte celular, un mecanismo de seguridad para evitar que se produzca una situación de aneuploidía, generalmente con consecuencias graves para el organismo.
Mientras que las proteínas centroméricas estructurales (como CENP-B), mantienen una localización estable a lo largo de toda la mitosis, incluida telofase, los componentes del checkpoint de mitosis se ensamblan en el cinetocoro en altas concentraciones en ausencia de microtúbulos y su concentración disminuye a medida que aumenta el número de microtúbulos anclados al cinetocoro. En metafase, los niveles de CENP-E, Bub3 y Bub1 disminuyen de 3 a 4 veces con relación a los presentes en cinetocoros no anclados, mientras que los niveles de dineína/dinactina, Mad1, Mad2 y BubR1 caen >10-100 veces. Por tanto en metafase, cuando todos los cromosomas están congregados en la placa metafásica, se liberan las proteínas del checkpoint. La desaparición de las proteínas del checkpoint de los cinetocoros marca el momento en que los cromosomas han alcanzado la placa metafásica y se encuentran en tensión bipolar. Es entonces cuando las proteínas del checkpoint que se unen e inhiben Cdc20 (Mad1-Mad2 y BubR1), lo liberan, permitiendo la activación del APC/CCdc20, que dispara la separación de las cromátidas hermanas y consecuentemente el inicio de la anafase.
Varios estudios indican que el complejo Ndc80 interviene en la regulación de la asociación estable de Mad1-Mad2 y dineína con los cinetocoros. Sin embargo, las proteínas asociadas con el cinetocoro CENP-A, CENP-C, CENP-E, CENP-H y BubR1 son independientes de Ndc80/Hec1. La prolongada parada en prometafase que se observa en células con niveles reducidos de Ndc80/Hec1 depende de Mad2, a pesar del hecho de que en estas células muestran niveles de Mad1, Mad2 y dineína en sus cinetocoros que son menores del 10-15% a los observados en cinetocoros no anclados. Sin embargo, si además de Ndc80/Hec1 se disminuyen los niveles de Nuf2, Mad1 y Mad2 desaparecen completamente de los cinetocoros y el checkpoint se inactiva.
Las proteínas denominadas Shugoshinas (MEI-S332 en Drosophila melanogaster) son un tipo de proteínas asociadas con los centrómeros que son esenciales para mantener las cohesinas unidas a los centrómeros hasta anafase. La proteína homóloga en humanos, hsSgo1, se asocia con los centrómeros durante profase y desaparece al inicio de la anafase. Cuando se disminuyen los niveles de Shugoshina mediante RNAi en células HeLa, las cohesinas no se pueden mantener en los centrómeros durante mitosis, y en consecuencia, las cromátidas hermanas se separan asincrónicamente antes de que se inicie la anafase, lo que dispara una parada mitótica prolongada.
Por otro lado, el grupo de Dasso y colaboradores encontraron que las proteínas del sistema Ran: RanGAP1 (una proteína activadora de GTPasas que estimula la conversión de Ran-GTP en Ran-GDP) y la proteína de unión a Ran denominada RanBP2/Nup358, pueden detectarse en los cinetocoros durante mitosis. Estas proteínas se encuentran en los poros nucleares durante interfase e intervienen en el transporte núcleo-citoplásmico. La localización cinetocórica de estas proteínas parece ser significativa funcionalmente, porque una variedad de tratamientos que elevan los niveles de Ran-GTP inhiben la liberación de las proteínas Bub1, Bub3, Mad2 y CENP-E de los cinetocoros.
Curiosamente, Orc2 (una proteína del complejo de reconocimiento de origen -ORC por sus siglas en inglés- implicado en la iniciación de la replicación del ADN durante la fase S) también se localiza en los cinetocoros durante mitosis en células humanas; en concordancia con esta localización, algunos estudios indican que Orc2 en levaduras está implicada en la cohesión de cromátidas hermanas, y su eliminación celular provoca la activación del checkpoint de mitosis. También se ha detectado que otros componentes del complejo ORC (como orc5 en S. pombe) intervienen en cohesión. Sin embargo, la ruta molecular en la que intervienen las proteínas ORC parece ser aditiva a la ruta de las cohesinas y se desconoce en su mayor parte.
La mayor parte de los movimientos cromosómicos en relación con los polos del huso mitótico están asociadas con el alargamiento y acortamiento de los kMT. Una de las características más interesantes de los cinetocoros es su capacidad de modificar el estado de sus kMT asociados (alrededor de 20) de un estado de despolimerización de sus extremos (+) a un estado de polimerización. Esto permite a los cinetocoros de las células en prometafase mostrar "inestabilidad direccional", variando entre fases persistentes de movimientos hacia el polo (poleward) o inversos (anti-poleward) que están acoplados con estados alternados de despolimerización y polimerización de los kMT, respectivamente. Esta bi-estabilidad de los cinetocoros parece ser parte de un mecanismo para alinear los cromosomas en el ecuador del huso sin perder la conexión mecánica entre los cinetocoros y los polos del huso. Se cree que la bi-estabilidad de los cinetocoros se basa en la inestabilidad dinámica del extremo (+) de los kMT y está controlado de forma parcial por la tensión existente en los cinetocoros. En células de mamífero en cultivo, una baja tensión en los cinetocoros promueve el cambio hacia la despolimerización de kMT, y una alta tensión promueve el cambio hacia polimerización de los kMT.
Las proteínas del cinetocoro y proteínas que se unen a los extremos (+) de los MT (denominadas genéricamente +TIPs) regulan el movimiento del cinetocoro mediante la regulación de la dinámica de los extremos (+) de los kMT. Sin embargo, la interfaz cinetocoro-microtúbulo es muy dinámica, y algunos de estas proteínas parecen ser componentes bona fide de ambas estructuras. Dos clases de proteínas parecen ser particularmente importantes: kinesinas que funcionan como despolimerasas, tales como las kinesinas KinI; y proteínas que se unen a extremos (+) de MT, +TIP, que promueven la polimerización, quizás antagonizando el efecto de las despolimerasas.
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