La secuenciación de proteínas es el proceso práctico de determinar la secuencia de aminoácidos de toda o parte de una proteína o péptido. Esto sirve para identificar a la proteína o caracterizar sus modificaciones postraduccionales. Usualmente, la secuenciación parcial de una proteína provee la información suficiente (uno o más fragmentos) para identificarla con bases de datos de proteínas derivadas de la traducción conceptual de los genes.
Los dos métodos directos más importantes para secuenciar proteínas son la espectrometría de masas y la degradación de Edman usando un secuenciador. Los métodos de espectrometría son actualmente los más utilizados para la secuenciación e identificación, sin embargo, la degradación de Edman aún se mantiene como una herramienta valiosa.
Es deseable conocer la composición desordenada de los aminoácidos previo a la determinación de la secuencia ordenada pues esto facilita el descubrimiento de errores en el proceso de secuenciación así como la distinción entre resultados ambiguos. El conocimiento de la frecuencia de cierto aminoácido puede ser usado también para elegir cual peptidasa usar para la digestión(separación) de la proteína. La incorporación errónea a las proteínas de bajos niveles de aminoácidos no estándar (como la norleucina) también puede ser determinada. El método generalizado (usualmente nombrado como análisis de aminoácidos) para determinar la frecuencia de aminoácidos es el siguiente:
La hidrólisis se realiza al calentar una muestra de proteína con ácido clorhídrico 6 mol L-1 a 100-110 °C durante 24 horas o más. Las proteínas con muchos grupos voluminosos e hidrofóbicos pueden requerir periodos de calentamiento mayores. Sin embargo, estas condiciones son tan fuertes que algunos aminoácidos (serina, treonina, tirosina, triptófano, glutamina y cisteína) se degradan. Para evitar este problema, se sugiere que se calienten muestras separadas durante diferentes tiempos, analizando cada disolución resultante y extrapolando a cero el tiempo de hidrólisis. También se sugiere una variedad de reactivos para prevenir o reducir la degradación como tioles o fenoles para proteger el triptófano y la tirosina del ataque del cloruro, así como pre-oxidar la cisteína. También se sugiere medir la cantidad de amoniaco formado para determinar la hidrólisis de las amidas.
Los aminoácidos pueden ser separados por cromatografía de intercambio iónico y después derivatizados para facilitar su detección. Más comúnmente, los aminoácidos son derivatizados y después analizados por cromatografía de fase inversa.
Un ejemplo de la cromatografía de intercambio iónico se da por la NtrC (proteína C reguladora del nitrógeno) usando poliestireno sulfonatado como matriz (resina de intercambio iónico). Al añadir los aminoácidos en solución ácida y hacerlos pasar por un buffer que incremente poco a poco el pH, los aminoácidos son eluidos cuando el pH alcanza su respectivo punto isoeléctrico (pI). Como cada aminoácido posee un pI diferente, son separados. Una vez que los aminoácidos han sido separados, sus cantidades son determinadas al añadir un reactivo que formará un derivado colorido. Si las cantidades superan los 10 nmol, se puede utilizar ninhidrina, dando un color amarillo al reaccionar con la prolina y púrpura al reaccionar con el resto de los aminoácidos. La concentración de los aminoácidos es entonces proporcional a la absorbancia de la solución resultante (ley de Lambert-Beer) y se puede usar espectroscopía UV-visible. Con cantidades pequeñas (inferiores a los 10 pmol), se pueden formar derivados fluorescentes utilizando reactivos como ortoftaldehído o fluorescamina y se utiliza espectroscopía de fluorescencia.
La derivatización previa a la columna utiliza el reactivo de Edman para producir un derivado que es detectable por espectroscopía UV-visible. Una mayor sensibilidad es lograda al utilizar un reactivo que genere derivados fluorescentes. Los aminoácidos derivados son susceptibles de ser usados en cromatografía de fase inversa, usualmente usando una columna de gel de sílica C8 o C18 y un gradiente de elución optimizado. Los aminoácidos eluidos son detectados usando un detector de UV o de fluorescencia y los picos resultantes son comparados con estándares para cuantificar las muestras.
La determinación del aminoácido N-terminal de una cadena peptídica es útil por dos razones: para ayudar al ordenamiento de fragmentos en una cadena y porque el primer ciclo de la degradación de Edman usualmente se contamina por impurezas y no da una determinación certera del primer aminoácido N-terminal. Un método generalizado para el análisis del aminoácido N-terminal es:
Existen diferentes reactivos que pueden ser usados para marcar el aminoácido terminal. Todos reaccionan con grupos amino y por lo tanto pueden enlazarse con aminas en las cadenas laterales como las de la lisina, por esta razón, es necesario ser cuidadoso en la interpretación de los cromatogramas para asegurar que se ha elegido el aminoácido correcto. Dos de los reactivos más comunes son el reactivo de Sanger (1-fluoro-2,4-dinitrobenceno) y derivados del dansilo. El fenilisotiocianato, reactivo usado en la degradación de Edman, también puede ser usado. Los reactivos producen derivados coloridos y solo se requiere análisis cualitativo por lo que los aminoácidos no necesitan ser eluidos de la columna de cromatografía, solo comparados con un estándar. Otra consideración es que, como la mayoría de los grupos amino reaccionan, la cromatografía de intercambio iónico no se puede usar. En su lugar, se usa cromatografía en capa fina y HPLC.
El número de métodos disponibles para el análisis del aminoácido C-terminal es mucho menor que para el aminoácido N-terminal. El método más común es añadir carboxipeptidasas a una solución de la proteína, tomar muestras en intervalos regulares y determinar el aminoácido terminal analizando una gráfica de concentraciones de aminoácido respecto al tiempo. Este método es muy útil en el caso de que los polipéptidos tengan el grupo N-terminal bloqueado. La secuenciación de grupos C-terminales es de gran ayuda en la verificación de estructuras primarias de proteínas predichas por las secuencias de ADN y para detectar algún procesamiento postraduccional de productos genéticos de secuencias de codones conocidas.
La degradación de Edman es una reacción importante para la secuenciación de proteínas debido a que permite descubrir la composición ordenada de los aminoácidos de una proteína. Los secuenciadores automáticos de Edman son muy utilizados y permiten secuencias péptidos de 50 aminoácidos de largo. El procedimiento para secuenciar proteínas mediante la degradación de Edman es el siguiente:
Péptidos mayores a 50 aminoácidos no pueden ser secuenciados confiablemente por la degradación de Edman pues aparecen interferencias. Debido a esto, cadenas proteicas largas deben ser separadas en fragmentos pequeños que después pueden ser secuenciados individualmente. La digestión se puede hacer mediante endopeptidasas como la tripsina o la pepsina o mediante agentes químicos como el bromuro de cianógeno. Enzimas diferentes dan patrones de separación diferentes. Los traslapes entre fragmentos pueden ser usados para construir una secuencia general.
El péptido a secuenciar es adsorbido en una superficie sólida. Un sustrato común es la fibra de vidrio cubierta con polibreno (un polímero catiónico). El reactivo de Edman, fenilisotiocianato, es añadido al péptido adsorbido junto con una solución buffer ligeramente básica de trimetilamina al 12%. Esto reacciona con el grupo amino del aminoácido N-terminal.
El aminoácido terminal puede ser desorbido selectivamente por la adición de un ácido anhidro. El derivado se isomeriza para dar una fenilhidantoína sustituida, la cual puede ser enjuagada e identificada mediante cromatografía, después, el ciclo se repite. La eficiencia de cada paso es del 98%, lo que permite que se identifiquen cerca de 50 aminoácidos antes de perder la confiabilidad.
Un secuenciador de proteínas es una máquina que permite llevar a cabo la degradación de Edman de manera automática. Una muestra de la proteína o péptido se coloca en el matraz de reacción del secuenciados y la degradación de Edman se lleva a cabo. Cada ciclo libera y derivatiza un aminoácido N-terminal de la proteína que es después identificado mediante HPLC. El proceso de secuenciación se repite para todo el polipéptido hasta que la secuencia completa se establece o hasta que se cumple un número de ciclos programado.
La identificación de las proteínas es el proceso de asignar un nombre a una proteína de interés (POI, protein of interest en inglés) basado en su secuencia de aminoácidos. Usualmente solo una parte de la proteína requiere ser determinada experimentalmente para identificar la proteína al compararla con bases de datos de secuencias proteicas deducidas de secuencias de ADN. La caracterización posterior incluye la confirmación de los extremos N y C de la POI.
Un esquema general de la identificación de proteínas es el siguiente:
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